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噬菌體展示文庫體外篩選的通用步驟

1．通過腹腔注射濃度為1．25％（w/v）的阿佛丁來麻醉小鼠。2．打開胸腔并暴露心臟。3．用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。4．連同一個(gè)或多個(gè)對(duì)照器官一起，取出要研究的器官和組織，并將其置于一個(gè)直徑為30m的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。5．用無菌刀片將每個(gè)器官或組織都切碎。6．將切碎的器官或組織放到2．2m1的無菌塑料管中，并加入1．8m10．5mg/m1的膠原酶?；靹虿⒃?7℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養(yǎng)時(shí)，持續(xù)搖動(dòng)樣品。7．以1500r/min的速率短暫離心細(xì)胞懸液5分鐘，并棄...

pG6質(zhì)粒簡介，pG6質(zhì)粒說明

pG6質(zhì)粒是噬菌體顆粒載體，是為融合蛋白的單價(jià)展示設(shè)計(jì)的。來自輔助噬菌體的野生型pⅥ與噬菌體顆粒載體表達(dá)的pⅥ-cDNA的融合蛋白競爭合成原始的噬菌體顆粒。在多鏈接區(qū)域除了有一個(gè)額外的SalI位點(diǎn)以外，實(shí)際上噬菌體顆粒載體pG6A、pG6B、pG6C與載體pDONG6是等同的，pDONG6允許在gⅥ的3’末端進(jìn)行eDNA文庫克隆。從lac啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生雙側(cè)順反子mRNA：*條順反子在lacZ和gⅢ3’末端之間編碼一個(gè)融合蛋白，而第二條順反子包含了gⅥ-eDNA融合基因。g...

從預(yù)制的入GTll文庫中制備cDNA插入片段

[方法]A.PCR擴(kuò)增cDNA插入片段1．在冰浴中將以下成分加到0．2m1微量離心管中（執(zhí)行10步反應(yīng)）●水，36．5ul●10×Pfu緩沖液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制備好的Sfi-NotIλGTllcDNA文庫，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反應(yīng)物并用50ul的礦物油覆蓋。3．在95℃下使模板變性2分鐘，...

從外周血淋巴細(xì)胞（PBls）中分離RNA

[方法]1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細(xì)胞。2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細(xì)胞3次。3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細(xì)胞，并加入7ml裂解緩沖液（可溶解達(dá)到5×108個(gè)外周血淋巴細(xì)胞），然后劇烈渦旋振蕩以溶解細(xì)胞。4．加入7體積（49m1）4m01/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時(shí)（過夜）。5．將懸液轉(zhuǎn)移到30mlCorex管內(nèi)，在吊桶式轉(zhuǎn)頭內(nèi)4℃離心2小時(shí)，6500r/min。6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰（大約15m...

cDNA*鏈的合成

[方法]1．為合成cDNA*鏈，在1個(gè)1．5ml硅化微量離心管中制備以下反應(yīng)混合液，●10－RT緩沖液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物濃度均為10pmol/ul2．取整數(shù)體積（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1個(gè)無菌1．5ml微量離心管內(nèi)，并用微型離心機(jī)離心5分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干，并用24．5ul...

scFv和載體DNA的連接

[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個(gè)100ul連接混合液，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫，另1個(gè)用于Vu-VλscFv文庫，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)。對(duì)照可以確定未切的載體有多少（對(duì)照2），以及確定無插入序列時(shí)有多少重新連接的載體（對(duì)照1）。要保持恰當(dāng)?shù)谋壤?，所獲得的克隆數(shù)（對(duì)于相...

電感受態(tài)大腸桿菌TGl的制備

[方法]1．將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板，37℃過夜。2．將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m12XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過夜。3．用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個(gè)含500m12×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養(yǎng)約1．5小時(shí)，直到A600接近0．5。4．將菌液轉(zhuǎn)移4個(gè)預(yù)冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭。6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol...

在微量滴定板中表達(dá)可溶性scFv

[器材和試劑]●用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號(hào)62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實(shí)驗(yàn)方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。2...